Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Повреждения нейронов (нейроповреждения) приводят к необратимым изменениям в клетках, органах и функциях организма. Они происходят вследствие:

  • травм,
  • инфекционных и воспалительных процессов,
  • интоксикации,
  • наследственных заболеваний,
  • неспецифических патологий (гипогликемии, анемии, снижения мозгового кровообращения, рассеянного склероза и др.).

Канадские ученые недавно разработали новый универсальный метод восстановления связей между нейронами с применением лазера, излучающего фемтосекундные (предельно короткие) лазерные импульсы. Универсальность метода в том, что его можно применить для любого типа клеток, в том числе и тех, посредством которых передается информация.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Нейроны: как осуществляется межклеточная коммуникация

Передача информации в нервной системе происходит посредством электрического импульса и химического сигнала: этот тип связи осуществляется в синапсе — межфазовой контактной площадке двух нейронов.

Работа и ЦНС (центральной нервной системы), и ПНС (периферической нервной системы) происходит аналогично. Это возможно, благодаря нейронам и синаптической сети — средствам межклеточной коммуникации.

Строение нейрона

Типичный нейрон состоит из тела клетки (сомы), дендритов и аксонов:

  • Дендриты — это короткие и разветвленные отростки нейронов.
  • Аксон — это клеточное расширение, проходящее большие расстояния в теле человека и других биологических видов. Аксон может сделать несколько переходов и по окончанию подсоединиться к нескольким клеткам.

В головном мозге взрослого человека существует около 300 триллионов синапсов.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Передача нейронных связей

Связи между нервными клетками осуществляются такими способами:

  • от аксона одного нейрона к дендритам или сотовому телу другого;
  • от аксона к аксону;
  • от дендритов к дендритам и т. д.

Клеточные мембраны сомы и аксона активируют напряжение в электропроводящих закрытых ионных каналах (Ca, Na, K и хлорид-ионных).

Почему необратимы повреждения нейронов

Нейрон — специфическая клетка, не способная делиться, особенно в зрелом возрасте. Поэтому повреждение нерва из-за травмы может привести к нарушению функций периферической нервной системы.

Паралич после травм спинного и головного мозга, потеря чувствительности связаны с полным блоком проводимости -обрывом связей между эфферентными (двигательными) и афферентными (чувствительными) нейронами.

(Но утверждение о том, что нейрогенез у взрослого человека вообще не происходит, ошибочно. Да, нейрогенез зависит от многих внешних условий, и может угнетаться от вредных воздействий (радиации, химических веществ, стрессы), но появление новых нейронов происходит и у взрослых, особенно в гиппокампе, в височных отделах головного мозга.

Подробнее о регуляции нейрогенеза, о способах воздействия на него — в интересном видео в конце статьи).

Типы повреждения нейронов

  • Валлерова дегенерация:
    • Разрыв нерва, повреждение аксона и его миелиновой оболочки.
    • Через неделю после травмы начинается блокировка проводимости.
    • Восстановление возможно, если сохранена базальная мембрана (в ее функции входят производство миелина (Шванн клеток) и выбор (аппроксимация) нервных окончаний).
    • Результатом такого повреждения может стать мышечная атрофия в зоне иннервации нейрона.
  • Сегментная демиелинизация:
    • Повреждение ограничивается миелиновой оболочкой.
    • При сохранении аксона мышечная дистрофия не наблюдается.
  • Дегенерация аксонов:
    • Повреждается тело нервной клетки, и происходит дистальная гибель аксона.
    • Развитие мышечной атрофии происходит при отсутствии повторной иннервации от соседних нервов.
    • При таком типе повреждения возможно лишь частичное восстановление.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Экспериментальные методы восстановления повреждения нейронов

Последнее десятилетие ученые бьются над новыми методами, позволяющими не допустить блокировку проводимости и смерть аксонов после травмы и сохранить жизнеспособность нейронной сети:

  • Разрывы аксонов устранялись путем помещения поперек разрыва разрешительной матрицы.
  • Проводилась клеточная терапия ноотропными препаратами для стимуляции роста и регенерации поврежденных аксонов.
  • В качестве альтернативных методов при повреждениях миелиновой оболочки применяли ингибиторы роста ассоциативных нейронов и ингибиторы роста рубца.
  • Для предотвращения гибели клеток после травмы использовалась молекулярная защита.
  • Однако все эти обнадеживающие методы имели лишь частичный успех.
  • Пока не удается сделать главное:
  • Избирательно подсоединить конкретный аксон к телу клетки нейрона.

Когда удастся произвести соединение отдельных нейронов, в науке произойдет настоящий переворот и откроются двери для беспрецедентного исследования в области неврологии, физиологии, клеточной биологии и биохимии. Возможно будет лечить тяжелые травмы спинного мозга и периферические поражения нервной системы.

Лазерный метод соединения разрыва нейронов

Цели:

  • Восстановить связи между нейронами сразу после травмы и предотвратить блокировку проводимости.
  • Проверить гипотезу о физической привязанности и восстановлении при приближении нервных окончаний.

Лазерная технология с применением фемтосекундных импульсов — яркий кандидат для избирательного подсоединения нейронов. Она используется в нанохирургии как метод лечения рака:

  • для ортопорации (открытии переходного канала в клеточной мембране)
  • трансфекции (внедрении нуклеиновых кислот в ядерные клетки).
  1. Удалить или ионизировать можно материал размером менее дифракционного пятна без ущерба для окружающих тканей.
  2. Фемтосекундные лазерные импульсы были также использованы в качестве инструмента для изучения регенерации нейронов путем разделения нейронов и аксонов.
  3. Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером
  4. Но физическое соединение отдельных нейронов до сих пор не выполнялось.

Суть эксперимента

В результате испытания под воздействием лазерного излучения с точными параметрами настройки на культивированном в растворе DMEM биоматериале была произведена гемифузия (слияние) двух фосфолипидных мембран клеток нейронов.

Параметры лазерного излучения и биоматериал

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Слияние достигнуто с помощью фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 800нм, с параметрами излучения:

  • интенсивность и разрешающая способность соответственно:
    • 1,7 (± 0,08) x 10 12 Вт / см 2 и ± 0,5 мкм;
  • частота повторения 80Мгц;
  • эффективный размер пятна — 600нм.
  • идеальное время облучения составило один-два 15 мс импульсов (т.е. 1,2×106 импульсов).

В качестве биоматериала использовались:

  • P19 клетки тератокарциномы мыши;
  • Neuro2A клетки нейробластомы мыши;
  • телячья, бычья и коровья сыворотка.

На рис. 1 представлены суть эксперимента:

  1. Фемтосекундный лазерный импульс доставляется в целевую точку между аксоном и телом нервной клетки (сомой).
  2. Фосфолипидные бислои нейрона сомы и аксона до воздействия лазера (кругом отмечена область прикрепления фософолипидных слоев).
  3. Лазерный импульс высокой интенсивности вызывает обратимую дестабилизацию обеих фосфолипидных слоев. Под воздействием фемтосекундного лазерного импульса в индуцированной зоне слияния аксон-сома сгенерированные свободные ионы (показаны красным цветом) и свободные электроны (показаны оранжевым) пересекают неполярную центральную область и разрывают связи между жирными кислотами гидрофобных хвостов.
  4. В результате процесса релаксации в целевой точке формируются новые стабильные связи и особая гемифузионная клеточная мембрана — общий фосфолипидный бислой.

Как проводилось лазерное соединение нейронов

  • Выбирались и выделялись клетки для соединения и приводились в контакт с использованием оптического пинцета таким образом, чтобы выступающий аксон одного нейрона коснулся сомы другого нейрона.
  • Клетки оставлялись на какое-то время, чтобы убедиться, что между ними не происходит естественного слияния, после чего они растаскивались оптическим пинцетом.
  • Затем нейроны опять сближали и при помощи фемтосекундных лазерных импульсов облучали область между аксоном и сомой клетки.
  • Для подтверждения соединения один из нейронов перемещался пинцетом внутрь подвески чашки:
    • было обнаружено, что все остальные нейроны следовали за ним, скручивались и поворачивались как одно целое.

Рис.

 2 демонстрирует последовательность соединения одного нейрона к нескольким и создание цепочки нейронов с использованием фемтосекундных лазерных импульсов (стрелками обозначена связь аксона и сомы).

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

  1. Присоединение двух Neuro2A клеток, где аксон клеток (I) прилагается к соме (II).
  2. Второй аксон Neuro2A (I) соединяется с сомой Neuro2A (III).
  3. Демонстрируется неразрывность новых связей при повороте соединенных клеток на 30° относительно прежнего положения.
  4. Определены и выделены две группы четырех P19 клеток.
  5. Аксон нейрона (I) вступил в контакт и был связан с сомой (II) с помощью фемтосекундных лазерных импульсов, и обе группы соединились.
  6. Положение цепочки после того, как ее повернули оптическим пинцетом.

Таким образом были прикреплены несколько групп нейронов.

Заключение

На протяжении всего наблюдения и проведенных манипуляция нервные клетки показали свою жизнеспособность и прочность крепления.

Фемтосекундный лазер-индуцированной способ соединения нейронов потенциально может обеспечить научный прорыв, который откроет новые горизонты в исследованиях влияния соединительных нейронов прямо перед или после травмы.

Сохранение жизнеспособности нейронной сети позволит исследователям изучать новые сложные патофизиологические процессы, такие как нейрогенез, валлеровская дегенерация, сегментарная демиелинизации и дегенерация аксонов.

Это позволит дальнейшее развитие новых методов лечения нервных травм и болезней.

(По материалам статьи научного журнала Nature. Scientific reports)

Видео: Взрослый нейрогенез

(118

Источник: https://ZaSpiny.ru/novosti/vosstanovlenie-neironov.html

Фемтосекундный лазер

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазеромFemto-Lasik — эффективный способ, доступный населению в целях выполнения лазерной коррекции зрительного восприятия. Lasik расшифровывается как «лазерный кератомилез». Фемто представляет технологию, в данном случае самый последний тип лазера — высокочастотный, фемтосекундный.

FEMTO-LASIK — манипуляция, состоящая из двух шагов, в которых используется два разных устройства, создающих узкий пучок интенсивного света.

На 1 этапе офтальмолог-хирург делает небольшой роговичный лоскут и подготавливает зрительный орган ко второму этапу — коррекции зрительного восприятия.

С Фемто-ЛАСИК врачи легко и успешно корректируют зрение пациента, если в рецепте указаны параметры от-12 до +6 диоптрий.

Когда применяют фемтосекундный лазер

Почти все люди с близорукостью (миопией), дальнозоркостью (гиперметропией) или астигматизмом — кандидаты для проведения данной операции.

Процедура одобряется, если:

  • пациенту 18–60 лет;
  • аномалия рефракции между -12 и +6;
  • зрительное восприятие за последний год не изменилось и находится в стабильном состоянии.

Для возрастных проблем с ухудшением зрительного восприятия, иначе известных как возрастная дальнозоркость, процедура не является целесообразным вариантом. Врачи рекомендуют мультифокальные имплантаты.

Лечение следует отложить во время беременности или при грудном вскармливании, пациентам со следующими патологиями:

  • вирусные глазные инфекции;
  • герпес;
  • сахарный диабет;
  • кератоконус и любые патологии, требующие терапии кортизоном.

Устройство лазера

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазеромМетодика безножевой коррекции зрения получила широкое распространение, несмотря на то, что используется всего несколько лет. Задача фемтосекундного лазера — создать тончайший лоскут роговой оболочки заданной толщины.

Читайте также:  Вывих голеностопного сустава: симптомы и первая помощь при травме

Устройство аппарата:

  • встроенные средства синхронизации частоты повторения импульсов;
  • оптоволоконный выход или окно (через них передается выходная мощность лазера);
  • оснащено быстро отслеживающей системой положения глаза;
  • генератор (оптоволоконный с диоидной накачкой);
  • усилитель, который включает регулятор дисперсии и/или оптические элементы;
  • модуль растяжения и сжатия;
  • чипированное зеркало, встроенное в регулятор дисперсии или волокно, решетку, призму, и чипированный пропускающий оптический элемент.

Особенности работы фемтосекундного лазера

Лазер работает на предельно высоких скоростях: импульсы 1 квадриллионной доли секунды, или 1 фемтосекунда. Для сравнения — 1 фемтосекунда относится к обычной секунде, как 1 сек к 32 миллионам лет.

Луч инфракрасного света фокусируется вглубь прозрачной наружной оболочки глаза на пятно размером в один микрометр (1e-6). Импульс сжигает мало ткани роговой оболочки, а продукты горения образуют пузырек, который раздвигает волокна и позволяет приподнять лоскут для дальнейшего проведения операции.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазеромЗа ¼ секунды устройство издает более 10 тысяч импульсов, которые складываются в один точно рассчитанный разрез. Поэтому офтальмологические хирурги способны сформировать лоскут роговой оболочки, который полностью рассчитан по длине, толщине и центровке.

При коррекции дальнозоркости, астигматизма или близорукости создаются не разрезы, а лоскуты. Этапы проведения безножевой процедуры:

  1. Формируется роговичный лоскут с помощью фемтосекундного лазера.
  2. Лоскут отодвигается в сторону хирургическими щипчиками.
  3. Обнаженная часть обрабатывается эксимерным лазером.
  4. Обработанная область промывается антисептическими растворами, роговой лоскут укладывается на место.
  5. Операция завершается закапыванием капель. Швы не накладываются.

В накладывании швов нет необходимости, поскольку разрушается незначительная часть ткани. Благодаря этому она быстро заживает.

Преимущества и недостатки фемтолазерной коррекции

К преимуществам процедуры относят:

  • Безопасность. Глаз не соприкасается с лезвием. Отделение роговицы от нижних слоев более точно и безопасно с помощью лазера, чем с помощью микрокератома. После разрезания лоскута так называемые «тканевые мостики» не образуются. Микротравм в тканях роговой оболочки меньше. Система Femto LDV позволяет хирургу увеличить лазерный диапазон глаза, вызывая, таким образом, меньше ореолов (круги вокруг источников света). Шансов получить воспаление практически нет, поэтому после процедуры нужно применять противовоспалительные глазные капли всего 5 суток.
  • Точность. Работа устройства контролируется компьютером. Врач наблюдает за работой лазерного луча с монитора. Параметры лоскутка легко изменяются и адаптируются в соответствии с индивидуальным строением органа зрения. Вакуум обеспечен, с помощью компьютера, управляемой системой. Это позволяет поддерживать устойчивое давление во время процедуры.
  • Лучшая технология. Лазерная техника защищает роговицу и оказывает минимальное влияние на окружающие ее ткани.
  • Обеспечивает уменьшение индуцированного сухого кератоконъюнктивита в результате влияния на снижение чувствительности прозрачной наружной оболочки глаза.
  • Лоскут тоньше. Меньше нарушает роговицу, поэтому она быстрее заживает после операции. Это повышает безопасность и снижает риск эктазии.
  • Скорость. Операция длится несколько минут. Период реабилитации быстрее, чем при других способах коррекции зрения. Пациент видит окружающий мир четко и ясно спустя несколько часов после применения фемтолазерной коррекции.
  • При хирургическом вмешательстве не повышается внутриглазное давление. Благодаря этому снижается повреждающее воздействие на ретину и, следовательно, развивается меньше осложнений.
  • Фемтосекундный лазер подходит для пациентов с очень тонкой роговой оболочкой.
  • Создает для каждого человека индивидуальный угол боковой резки, его положения и длины. Позволяет выполнить оперативное вмешательство пациентам с плоской роговой оболочкой.

Коррекция зрения дает новые возможности. С помощью фемтосекундного лазера есть возможность проводить коррекцию зрительного восприятия пациентам с тонкой роговицей и синдромом сухого глаза, а также с другими аномалиями глаза, которым отказали в проведении лазерной процедуры.

Несмотря на значительный перечень плюсов, процедура имеет несколько недостатков. После хирургического вмешательства у пациента появляется фотофобия. Повышенная чувствительность к источникам света — временный побочный эффект, который лечится при применении послеоперационных капель.

Второй недостаток — образование радужных кругов. Возникают вокруг источников света. Побочный эффект тоже временный, быстро проходит.

Третий — образование неровных краев лоскута и роговичной поверхности. В итоге пациента ожидают дефекты оптики в виде неправильного астигматизма.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером В инновационном центре «Сколково» презентовали новый препарат для лечения зрения. Лекарство не является коммерческим и не будет рекламироваться… Читать полностью

Процент осложнений при использовании данной техники коррекции зрительного восприятия — 0,1. Риск появления побочных эффектов ничтожно мал.

Фемтосекундный лазер в инновационных операциях

Если ранее применение рассматриваемого устройства ограничивалось лишь восстановлением зрительного восприятия, то сегодня область применения фемтолазера расширяется.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазеромТехнология применяется для лечения катаракты. Ранее фемтосекундный лазер не использовался при данном заболевании. Сейчас врачи выполняют разрезы длиной не более 3 мм на патологическом участке. При этом специалист контролирует глубину проникновения лазерного луча, не повреждает кровеносные сосуды.

В день проведения Фемто-ЛАСИК повторяют все предоперационные измерения. Затем пациенту дают легкое успокоительное. В глаза закапывают местный анестетик. Нет необходимости в полной анестезии.

Медсестры помогут сесть на операционный стол, расположенный в процедурной комнате.

Тщательно продезинфицируют обезболенные глаза и накроют их стерильной повязкой. Ресницы будут отодвинуты в сторону, а глаза снова обезболиваются с помощью местного анестетика. Устанавливается держатель век, из-за чего невозможно моргнуть или закрыть глаза.

После выполнения надрезов и дробления патологических образований до эмульсии хирург вводит хирургический инструмент в прозрачное тело. С его помощью извлекаются белковые образования.

Процедура — от прибытия до выписки – занимает около 2 часов.

Источник: https://proglazki.ru/lazernaya-korrektsiya/femtosekundnyj-lazer/

«Нано» резать!

Статья на конкурс «био/мол/текст»: В давние века люди использовали в качестве инструментов заточенные камни. Затем им на смену пришли металлические изделия, надолго закрепившиеся в руках у людей. Однако наука продолжает искать более точные и эффективные орудия для достижения целей.

При операциях на клетках и тканях долгое время использовали классические металлические, стеклянные и пластиковые инструменты. В XX веке появились оптические инструменты, которые позволили ученым проводить субмикроскопические операции с клетками и внутри них. Лазерные импульсы, воздействуя на клетку в течение нескольких фемтосекунд (10−15 с) могут вносить нанометровые (10−9 м) разрезы.

В этой статье будут кратко описаны прошлое, настоящее и возможное будущее фемтосекундной лазерной нанохирургии.

Обратите внимание!

Эта работа опубликована в номинации «Бионанотехнология» конкурса «био/мол/текст»-2016.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

  • Спонсор номинации — Фонд инфраструктурных и образовательных программ Роснано.
  • Генеральным спонсором конкурса, согласно нашему краудфандингу, стал предприниматель Константин Синюшин, за что ему огромный человеческий респект!
  • Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма «Атлас».

О возможности применения света для проведения операций на биологических объектах заговорили еще в 1912 году. Первым этот метод, который позже был назван «ультрафиолетовым микроуколом», применил российский ученый, биофизик С.С. Чахотин. Он сам сконструировал установку из микроскопа, источника УФ-излучения и оптических элементов.

В качестве источника излучения он использовал искру, возникающую между магниевыми электродами. Разработанная установка позволяла сфокусировать луч света размером от 5 до 2 мкм на препарате.

Чахотин облучал светочувствительные глазки эвгленовых водорослей, чтобы изучить их фототаксис, с помощью света партеногенетически активировал яйца морских ежей, исследовал влияние света на водоросли и грибы [1].

Позже, в 50-х годах, этот инструмент доработали Бессис и Номарский, которые смогли сфокусировать ультрафиолетовый луч уже на субмикронные объекты. Это позволило им проводить опыты на отдельных клеточных органеллах. Однако долгое облучение клеток зачастую сильно травмировало или вовсе убивало их. Требовался другой, более мощный и надежный инструмент.

В 1960 году он появился. Теодор Майнман, американский физик, создал первый рабочий лазер — на основе искусственного рубина. Мощное излучение позволило ученым-фотобиологам сократить время воздействия света на объект до микросекунды. Прошли первые опыты по инактивации органелл: сначала воздействием рубинового лазера в течение 500 микросекунд удалось «отключить» митохондрии в клетке.

Затем, уже с помощью аргонового лазера и воздействия всего в течение 20–30 микросекунд, ученые разрезали хромосомы [2]. Эти опыты открыли новые возможности по изучению ядра и функционированию генетического материала. Сейчас в биологических исследованиях чаще всего используют титан-сапфировый лазер, поскольку у него достаточно широкая полоса излучения и большая энергия импульса.

Достаточно быстро лазеры стали использовать повсеместно: в науке, медицине, промышленности и даже косметологии. Разные лазеры имели разные длины волн излучения, мощность, способы активации и др. (табл.). Одним из последних изобретений стал лазер на свободных электронах, спроектированный в 1971 и опробованный уже в 1976 году.

Пучок электронов проходит через ряд магнитов и, теряя энергию, преобразуется в поток фотонов.

В результате мы получаем мягкое рентгеновское излучение, которое может быть использовано в изучении структур органелл и даже молекул: разрешение таких лазеров стремится к одному ангстрему (0,1 нм), а значит, в будущем можно будет разглядеть даже отдельные атомы*.

Таблица. Сравнительная характеристика лазеров, применяющихся в фотобиологии

РубиновыйАргоновыйЛазер на свободных электронахТитан-сапфировый
Год создания 1960 1964 1971 1982
Активная среда Кристалл корунда (окись алюминия [Al2O3]), где часть атомов алюминия замещена ионами хрома (около 0,05 %) Газ аргон Кристалл корунда (Al2O3), где часть атомов алюминия замещена ионами титана
Источник накачки лазера (перевод активной среды в рабочее состояние) Импульсная лампа Электрический разряд Пучок свободных электронов в вакууме Другой лазер (обычно алюмо-иттриевый)
Свет Красный Синий и зеленый Красный Красный
Длина волны 694,3 нм не более 514 нм 0,085–6 нм 650–1100 нм
Мощность излучения 10–50 мВт 1–20 Вт несколько сотен кВт до 400 мВт
Применение Голография Офтальмология, накачка других лазеров Материаловедение, научные исследования, медицина Спектроскопия, научные исследования
Читайте также:  Народные средства от боли в копчике: как устранить в домашних условиях?

Чтобы снизить влияние лазера на клетку, ученые решили использовать краткосрочные воздействия. В начале фотобиологического пути речь шла о секундах и минутах, позже — о микросекундах.

С развитием лазерных инструментов ученые стали проводить внутриклеточные операции с помощью пикосекундных импульсов, а затем и фемтосекундных [8].

Такие короткие воздействия помогли изучить сверхбыстрые процессы, происходящие в клетке.

Фемтосекундные лазеры могут вносить тонкие изменения в хромосомы, митохондрии и другие органеллы, отдельные органы и ткани [9].

Это возможно, так как резко уменьшается разрешение лазера (до нескольких нанометров), понижается эффект накопления энергии и клетки не страдают от термического или физического шока.

Однако, есть и ограничения: при использовании оптических инструментов в клетке образуются активные формы кислорода, которые могут связываться с биомолекулами (например, ДНК, белками или липидами мембран) и вызывать гибель клетки [10].

Вместо хирургической стали — пучок света

До сих пор в классической биологии для микроопераций используют пьезоманипуляторы — микропипетки, микрозонды и микроскальпели, которые управляются механически или электронно.

Понятно, что это наносит повреждения клетке, даже если использовать самые маленькие инструменты и действовать ими крайне аккуратно. Лазерный луч фокусируется именно на нужном нам участке клетки и не повреждает соседние.

С его помощью можно осуществлять разрезы размером несколько нанометров, управляя с компьютера шириной и длиной луча, а также глубиной разреза (рис. 1).

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Рисунок 1. Воздействие фемтосекундным лазером на нейроны пиявки и одновременное перемещение клеток с помощью оптической ловушки с использованием фемтосекундного лазерного излучения (ФЛИ).

Последовательные кадры видеозаписи: а — начальное положение нейрона; б — смещение нейрона вниз; в — смещение нейрона влево.

Стрелками указано направление воздействия фемтосекундного лазера, кружком выделено место воздействия ФЛИ. Рисунок из [11].

Лазером можно не только резать и прокалывать, но также использовать его в качестве… пинцета. Световой пучок захватывает биологический объект и может перемещать его или удерживать в поле зрения в зависимости от цели исследования [11]. Замечательно, что речь идет не только о клетках, но и о субклеточных структурах — можно захватить ядро, ядрышко, различные везикулы и элементы цитоскелета.

В 2008 году, например, исследователи «захватили» молекулу мРНК [12]. Две пластиковые нанобусины были закреплены в «оптических ловушках». К одной из бусин была «пришита» молекула ДНК, которой была комплементарна молекула РНК, появляющаяся с помощью РНК-полимеразы.

Манипулируя лазерными лучами, исследователи сводили и разводили бусины, из-за чего молекула РНК сворачивалась и разворачивалась. Всего было записано около 800 «профилей растяжения».

После их подробного анализа впервые получилось в режиме on-line проследить за фолдингом синтезирующейся молекулы и даже выявить основные четыре стадии [12].

Разумеется, такое возможно не только с РНК: вероятно, в ближайшем будущем мы сможем прочесть о последовательных процессах сборки ДНК, сворачивании и компактизации хромосом или упаковки белка и других сложных биомолекул.

Где же работают нанохирурги?

Лазерная нанохирургия широко применяется в эмбриологии при редактировании эмбрионов или создании клонов. Для клонирования необходимо создать цитопласт — «пустой» ооцит без ядра или с нерабочим ядром, то есть провести энуклеацию.

Классический метод энуклеации заключается в механическом «извлечении» ядра с помощью микропипетки, при чем нарушается мембрана клетки и захватывается часть цитоплазмы. Такой метод достаточно травматичен для клетки и часто заканчивается ее гибелью.

С помощью лазера же, напротив, можно парой импульсов достаточно легко инактивировать материал ядра, не повреждая цитоплазму и ядерную мембрану (рис. 2) [13].

После лазерного удаления ядра, или пронуклеуса, ооцит готов к клонированию: в него пересаживают ядро от соматической клетки и наблюдают дальнейшее развитие*.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Рисунок 2. Лазерная энуклеация активированных ооцитов мыши. а — Активированный ооцит с ядром. б — После облучения ядра лазером ядро перешло в неактивное состояние. Рисунок из [13].

Что еще можно сделать с помощью наноскальпеля? Например, создать чистую линию животных. Для этого сливают два бластомера — клетки зародыша — и получают тетраплоидный, то есть с удвоенным набором хромосом, эмбрион [15].

При лазерном воздействии в нанолитровом объеме образуется плазма, которая и позволяет «пробуравить» стенки клеток зародыша.

В сравнении с эмбрионом область возникновения плазмы крайне мала, что и позволяет проводить слияние без ущерба для зародыша (рис. 3).

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Рисунок 3. Слияние двух пар бластомеров внутри четырехклеточного зародыша крысы. а — Слияние первой пары бластомеров. б — Слияние второй пары бластомеров.

 в — Двухклеточный зародыш, полученный в результате слияния. Окраска Hoechst 33342 подтверждает двойной набор ядер в каждом бластомере.

 г — In vitro развитие эмбрионов: вылупившийся и вылупляющийся зародыши. Рисунок из [15].

Как и контрольные, не слитые, эмбрионы, опытные прекрасно растут до стадии бластоцисты, и тогда в них вносят эмбриональные диплоидные клетки животного нужной линии. Чаще всего это трансгенные клетки, например, меченые флуоресцентной меткой*.

Природа придумала отличный способ борьбы с неполадками в эмбрионе — внесенные диплоидные клетки постепенно оттесняют клетки с неправильным набором хромосом, которые в итоге становятся его материнской частью — формируют плаценту, хорион и пуповину. В итоге, получается трансгенное животное, полностью состоящее из интересующих исследователей клеток.

Потом этого «мутанта» можно пересадить матери-реципиенту: эмбрион приживается в матке и через 14–16 дней рождаются крысята, светящиеся под УФ светом.

Лазеры могут помочь и в борьбе с раком. В одной из работ исследователи с помощью антител «навешивали» на клетки металлические шарики размером 70 нм. При облучении пикосекундными импульсами происходило неравномерное нагревание оболочки шарика.

Манипулируя «горячими областями», инкрустируя клетку разным количеством «бусинок», можно добиться полной фрагментации клеток или локальной оптопорации [18]. Такой фототермолиз — нагревание светом — может убивать раковые клетки.

Стоит только ввести необходимые антитела, увешанные металлическими «бусинками».

С помощью лазерных импульсов можно точечно нокаутировать клетки внутри 3D-кластера. Это особенно важно в культурах стволовых клеток (рис. 4), в них часто происходит спонтанная дифференцировка, что снижает чистоту популяции и может привести к образованию тератом [19].

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазером

Рисунок 4. Лазерное воздействие на человеческую стволовую клетку поджелудочной железы путем одиночного облучения (200 мВ, 10 мс) привело к появлению флуоресценции апоптотических маркеров аннексина V-Aleха Fluor (зеленый) и этидиум бромида (красный). а — До облучения. б — Через 5 минут после воздействия. Рисунок из [19].

Свой опыт

Сейчас я работаю в институте химической физики имени академика Семенова.

Мои коллеги используют лазеры для различных целей: кто-то совершенствует оптоперфорацию стенок клеток [20], кто-то создает «зеленых» мышей, вводя стволовые клетки в зародыш только с помощью лазера [21] или изучает структуры клеток.

Моя работа заключается в изучении влияния лазерного излучения на зародыши. Выше я писала о возможностях слияния эмбрионов и получения тетраплоидных бластомеров. Эмбрионы развиваются нормально, не отличаются в темпах роста или в морфологии от своих необлученных собратьев.

А можно ли работать с зародышами на более ранних стадиях? Что если мы будем редактировать еще неоплодотворенную яйцеклетку? В мире уже ведутся исследования по созданию «ребенка от трех родителей» [22] — можно ли внести митохондрии в ооцит с помощью лазера, и что мы получим?

Напишу небольшой спойлер: мы активно работаем с незрелыми ооцитами и после воздействия на них лазерными инструментами, и они великолепно превращаются в жизнеспособные яйцеклетки, готовые к дальнейшему оплодотворению. Выходит, лазерные инструменты действительно безопасны? Пока работа не окончена, рано делать выводы, однако мы надеемся доказать их универсальность и показать удобство работы с ними.

Итак..

Надеюсь, я показала вам, что фемтосекундные лазеры — неотъемлемые участники наноопераций. Пока что это единственный неинвазивный инструмент, который можно использовать для манипуляций на наноуровне. Конечно, многое еще не исследовано, поэтому далеко не все возможности используются.

Однако метод развивается, и возможно, что оптический «наноскальпель» и «нанопинцет» будут и дальше уменьшаться*. Может быть когда-нибудь мы будем говорить уже об инструментах с приставками атто- и иокто-, которые будут работать с отдельными молекулами или атомами, или даже с субатомными частицами.

А пока — до работы со столь малыми величинами нам еще расти и расти.

  1. Посудин Ю.И. Биофизик Сергей Чахотин. Киев: Изд-во Нац. аграрного ун-та, 1995. — 98 с.;
  2. Berns M.W., Olson R.S., Rounds D.E. (1969). Argon laser micro-irradiation of nucleoli. J. Cell Biol. 43, 621–626;
  3. биомолекула: «Фемтосекундные рентгеновские лазеры — кристаллография будущего»;
  4. Ловля бабочек, или Чем структурная геномика поможет биологии;
  5. Структурная геномика меняет курс;
  6. Структуры рецепторов GPCR «в копилку»;
  7. биомолекула: «Лаборатория перспективных исследований мембранных белков: от гена к ангстрему»;
  8. Kohli V. and Elezzabi A.Y. (2009). Prospects and developments in cell and embryo laser nanosurgery. Wiley Interdiscip. Rev. Nanomed. Nanobiotechnol. 1, 11–25;
  9. Fang-Yen C., Gabel C.V., Samuel A.D.T., Bargmann C.I., Avery L. (2012). Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177–206;
  10. Kuetemeyer K., Rezgui R., Lubatschowski H., Heisterkamp A. (2011). Mechanisms of femtosecond laser cell surgery in the low-density plasma regime. SPIE Proceedings. 7897. doi: 10.1117/12.874147;
  11. Барбашов Ю.В., Залесский А.Д., Березуцкая М.А., Максимов Г.В., Рубин А.Б., Саркисов О.М., Надточенко В.А. (2012). Нелинейно-оптическое воздействие фемтосекундного лазерного излучения ближнего ИК диапазона на морфологию и структуру нервной клетки в поле оптической «ловушки». Хим. Физика. 31, 9–15;
  12. Фолдинг «воочию»;
  13. Шахбазян А.К., Свиридова-Чайляхан Т.А., Карменян А.В., Кривохарченко А.С., Чои А., Чайлахян Л.М. (2009). Использование лазера для получения реципиентных цитопластов при пересадке ядер у млекопитающих. Докл. Акад. Наук. 428, 1–4;
  14. Жизнь в эпоху синтетической жизни;
  15. Krivokharchenko A., Galat V., Ganten D., Bader M. (2002). In vitro formation of tetraploid rat blastocysts after fusion of two-cell embryos. Mol. Reprod. Dev. 61, 460–465;
  16. биомолекула: «Флуоресцентные репортеры и их молекулярные репортажи»;
  17. биомолекула: «Биолюминесценция: возрождение»;
  18. Avetisyan Y.A., Yakunin A.N., Tuchin V.V. (2011). Novel thermal effect at nanoshell heating by pulsed laser irradiation: hoop-shaped hot zone formation. J. Biophotonics. 5, 734–744;
Читайте также:  Головная боль от компьютера: узнаем причины и принимаем меры

Источник: https://biomolecula.ru/articles/nano-rezat

Фемтосекундные лазеры и нанохирургия — лекции на ПостНауке

ВИДЕО ПостНаука в партнерстве с Российской венчурной компанией и Serious Science публикует для вас на русском языке материалы ведущих западных ученых, рассказывающих о главных направлениях исследований мировой науки.

Одна из сфер, первые исследования в которой провела моя группа в Гарварде, была обработка прозрачных материалов фемтосекундными лазерами. Для начала я бы хотел кратко объяснить, что такое фемтосекундный импульс лазерного излучения. Это сверхкороткий лазерный импульс, который длится миллионные миллиардной доли секунды 10-15. Когда лазерные импульсы настолько коротки, их интенсивность становится настолько высокой, что взаимодействие между светом и материей полностью меняется (с точки зрения стандартных взаимодействий, к которым мы привыкли), и это делает возможными многие интересные явления.

Представьте себе блок прозрачного материала, например стекла. Обычно, если вы фокусируете свет на стекле, ничего не происходит, свет просто проходит через него. Это и есть определение прозрачности: прозрачные материалы не меняют ход света, свет просто проходит через них. В случае с фемтосекундными лазерами это не так.

Если взять фемтосекундный импульс лазерного излучения и сфокусировать его внутри блока прозрачного материала, интенсивность в точке фокусировки будет настолько высока, что атомы в буквальном смысле разорвутся на части и создадут искру — плазму — состояние вещества, где электроны и ионы отделены друг от друга.

В конце 90-х мы открыли, что фокусирование коротких лазерных импульсов на прозрачном материале, таком как стекло, создает искру внутри материала и приводит к микровзрыву, образованию очень маленькой пустоты, вакуума (под «очень маленьким» мы имеем в виду размеры меньше микрона, или менее, чем одна сотая диаметра человеческого волоса, или даже около сотни нанометров, то есть одна тысячная диаметра человеческого волоса) внутри стекла. Как я уже говорил, такое невозможно создать с помощью обычного света, потому что при фокусировке он проходит насквозь.

Мы применяли эту технику в разных областях. Одна из них — это хранение информации. В обычном CD-диске на поверхности есть набор углублений, которые считывает лазер. Так можно хранить один слой информации, а в некоторых DVD-дисках можно хранить пару слоев.

Наша методика позволяет хранить сотни слоев, потому что их можно записать не только на поверхности, но и внутри стекла. Представьте себе, что вся ваша коллекция CD-дисков уместится на одной пластинке. Это хранение информации с высокой плотностью, и этот метод единственный в своем роде.

Другое применение — в микрогидродинамике, это создание очень маленьких каналов, по которым жидкость может течь, внутри прозрачного материала, такого как полимер или стекло.

На протяжении долгого времени мы изучали физику описанного взаимодействия. Как сильно плазма внутри стекла нагревается? Что выталкивает атомы из фокального объема в окружающий материал? Какова длительность этих эффектов? Параллельно с этим мы исследовали разнообразные области применения этого, о некоторых из которых я уже упоминал.

Одна из вещей, которую мы заметили с самого начала, — это то, что для создания этих маленьких пустот внутри твердого материала требуются лазерные импульсы с относительно высокой энергией.

Что мы имеем в виду под относительно высокой энергией? Многих джоулях? Нет, когда мы говорим об очень коротких отрезках времени, даже то количество энергии, которое мы обычно считаем маленьким, создает очень высокую интенсивность, потому что интенсивность — это, по сути, энергия, разделенная на время, в течение которого она подается.

Если мы возьмем один микроджоуль и, например, сто фемтосекунд, мы получим огромную мощность, сравнимую с мощностью, которая обеспечивает энергией город размером с Москву или Нью-Йорк. Конечно, она будет поставляться только несколько сотен фемтосекунд, но это невероятно высокая интенсивность для такого скромного количества энергии.

Сам процесс перехода от микросекунд к сотне фемтосекунд требует довольно много оборудования. Поэтому нам нужны были лазеры с усилением, и осцилляторы, и все возможные устройства, чтобы дать лазерному импульсу максимальное количество энергии и передать ее материалу.

Исследуя эту область уже несколько лет, мы поняли, что могли бы попробовать что-то новое и открыть применение фемтосекундным лазерам в полностью новой сфере. Когда мы генерируем фемтосекундный импульс, это не просто один импульс — мы получаем один импульс, повторяющийся с определенной частотой.

Лазер сам по себе генерирует импульсы высокой частоты, но низкой энергии. Чтобы ее увеличить, мы берем несколько лазерных импульсов — возможно, один импульс на каждую тысячную секунды вместо каждой миллионной — и увеличиваем энергию этого импульса до высокой.

Невозможно достичь одновременно высокой частоты и высокой энергии, так как для этого в буквальном смысле понадобилась бы пара атомных электростанций, чтобы сгенерировать необходимое количество энергии.

Если вы хотите использовать нормальное сетевое напряжение, вы можете использовать только несколько импульсов каждую миллисекунду, каждую тысячную секунды.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазеромЛазерное охлаждение и захват атомов лития-7

Именно такие импульсы мы использовали вначале — с очень высокой интенсивностью, но разделенные широкими промежутками времени, миллисекундой, для записи в стекле.

Но потом мы поняли, что если мы возьмем ряд импульсов, которые повторяются каждую миллионную долю секунды, даже несмотря на то, что их энергия будет значительно ниже, она будет накапливаться: один импульс достигает материала, и, пока его энергия еще не рассеялась из фокального объема, следующий импульс приходит, добавляя энергию, и так далее и так далее.

То есть если взять импульсы с энергией ниже в миллион раз, например, но с очень короткими промежутками между ними, то можно накопить энергию. Мы также узнали, что, если взять простой лазер, осциллятор, генерирующий ряд импульсов в пределах 60–80 МГц, можно накопить достаточно энергии, чтобы расплавить материал в фокальной точке.

Таким образом, вместо создания микровзрыва и пустоты мы фокусируем ряд лазерных импульсов с гораздо меньшим количеством энергии, но с высокой частотой повторения внутри стекла. Точка фокуса медленно нагревается, и стекло плавится до тех пор, пока мы не отключим лазер — тогда оно застывает. Плавится и снова застывает.

Но при плавлении со стеклом происходит нечто интересное: при застывании после плавления оно не полностью изменяет состояние вещества, не застывает в вещество с такой же плотностью и фазой, как раньше. Поэтому мы все равно можем записывать структуры, но не пустые, а с разными фазами вещества внутри стекла.

И что тут действительно круто, так это то, что мы можем двигать фокус внутри стекла. Мы можем либо двигать фокус при помощи подвижных зеркал или же передвигая стекло через фокус, при всем этом плавить стекло и давать ему затвердеть. В каком-то смысле мы можем записать структуры любой трехмерной формы.

И оказывается, что эти линии могут направлять свет — они действуют как волокно внутри стекла.

То есть, по сути, у нас есть механизм, как направить свет из точки А в точку Б, и мы можем развить это в разные типы структур, такие как разделитель лучей, демультиплексор, для использования в телекоммуникациях, кольцевых резонаторах и так далее.

Как только мы открыли это, огромное количество групп присоединилось к этому направлению, и теперь, когда приходишь на конференцию, можно найти целые отдельные собрания, посвященные работе с фемтосекундными лазерами.

Как я уже говорил, когда используется микрообработка с высокой частотой повторения, энергия импульса значительно уменьшается. На самом деле она переходит от микроджоуля в наноджоуль, а это практически ничто.

Это значит, что можно изменять материалы с очень низкой энергией, не создавая повреждений вокруг, потому что практически никакой энергии не рассеивается из фокального объема, то есть можно изменять материалы с очень высокой степенью точности.

Восстановление соединений нейронов фемтосекундным лазеромРасшифровка письменности майя

И еще одна область применения, которую показала моя группа, — это субклеточная хирургия. Можно провести микроманипуляции с органеллами внутри живой клетки или с мембраной, не убивая при этом клетку. Также можно использовать эту методику в нанонейрохирургии для разрывания соединений между отдельными нейронами в мелких животных.

Одно из очень привлекательных применений — хранение информации. Если бы мы могли получить действительно высокую плотность хранения информации в чем-то настолько же устойчивом, как стекло, это было бы гораздо лучше любого существующего на данный момент способа хранения информации.

Жесткие диски и флеш-память подводят, на данный момент нет такого способа хранения информации с такой же степенью безопасности сохранности, как на бумаге. Хотя бумага может сгореть и так далее, можно с уверенностью сказать, что, положив книгу в некоторое безопасное место, вы найдете ее там же через сто лет и найдете всю ту же самую информацию.

Это не так в случае с магнитными дисками, флеш-картами и другими механизмами хранения информации.

Поэтому метод с обработкой фемтосекундными лазерами очень привлекателен.

Однако на данный момент времени он непрактичен, так как за одну миллисекунду записывается один бит, и, если бы мы хотели записать всю информацию, которая влезает на пластинку размером с CD-диск, используя технологии нынешнего уровня, нам бы понадобилось целых 32 года.

Поэтому, несмотря на то что эта идея очень интересна, технологии пока что не обеспечивают достаточную частоту импульсов, для того чтобы сделать ее практичной. Это существенный барьер, и на его преодоление уйдет много сил.

Англоязычную версию видео сможно посмотреть по ссылке.

Источник: https://postnauka.ru/video/53386

Ссылка на основную публикацию